RNAi技术

清风明月

RNAi技术
& }* w8 Y9 P0 h6 R6 g$ a
       RNA干扰(RNA interference， RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA， siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。

1 RNAi的历史背景
       20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。他们将这一现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(TGS)或共抑制。此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。不同领域中的发现促使人们思考它们之间的可能联系。RNAi在果蝇中得到证实的同时，发现转座子翻转移位可启动RNAi，而转座子翻转移位所造成的同源基因沉默很似植物中的共抑制；在线饱霉实验中，发现PTGS过程中所必须的蛋白QDE1与RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)同源，提示PTGS过程中可能涉及到RNA复制及调节作用。同样在植物韧皮部注射dsRNA可遍及扩散到整个植株体产生RNAi；更有趣的是，把线虫浸润到含有dsRNA液体中或喂养表达dsRNA的工程菌也可以诱发RNAi。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。
5 n5 A+ g3 p( L0 D7 Q: z0 W7 i
2 RNAi的作用机理
       目前对RNAi的作用机理尚不清楚， RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，属于基因转录后调控，其中需要ATP的参与。通常认为dsRNA由核酸内切酶(RNA se Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA (在果蝇RNA se Ⅲ 被称为 dicer)，siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，然后RISC再特异性地与ｍRNA的同源区结合，通过酶的作用使ｍRNA降解，而产生基因沉默。靶ｍRNA被破坏后， RISC还可以再作用于其它靶分子。siRNA还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(KP)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对ｍRNA的抑制作用。
; i+ s; |4 A  E; `  E& q
. H1 u: g6 ?# c5 u% T' V3 RNAi的特点
       RNAi被美国科学杂志评为2001年十大科技突破之一，科学家对RNA干扰现象之所以表现出极大关注在于RNA干扰在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。RNAi有7个重要特征
/ m- Z$ v. L+ F+ B" |  l3.1 RNAi是dsRNA介导的PTGS机制
      在此过程中，注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应。翻译抑制剂对RNAi不产生影响。
6 S3 ^5 L' c; f6 |- ]3.2高特异性
        RNAi只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，而其他mRNA的表达则不受影响。
4 n7 W' w8 |" i1 Y3.3高效性
       无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA(几个数量级浓度)就能有效的抑制靶基因表达，抑制的效率在低等动物中>90%。这表明dsRNA介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的。
& K9 K* W# K3 E( c# ~0 y( a' b) B( h3.4 dsRNA长度限制性
5 I$ x) O+ T3 H  B0 @3 q' \       引发有效iRNA的dsRNA需要一个最小的长度。dsRNA小片段如小于21～23nt(如10～15nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21～23nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围。
3.5 RNAi有浓度、时间双重依赖性
- H2 x! l& `! d- V       dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强。高浓度的dsRNA产生较多的siRNA，不仅能增强反应体系的效应，而且还能抵消ADARs(RNA依赖的腺苷脱氨酶)的作用。实验表明，RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，干扰效应通常出现在注射dsRNA 6h后，可持续72h以上。
3.6可传播性
       基因表达的效应可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代。
, V. N" ], t$ P& P  `0 S0 l3.7 ATP依赖性
9 m9 h$ R7 y; y4 V6 z      在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应是必须由ATP提供能量。
  N8 I! o2 J0 ~6 y" k+ u6 V
3 B$ l' n6 }/ w' U, f8 o8 w( O* c- [) g4 RNAi技术的应用与展望
       依据RNA干扰现象，科学家建立了RNA干扰技术，即人为设计合成针对某特定基因序列的dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。但RNA干扰已被证实是一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段。它可有效地将靶基因的表达水平降到一个低的水平，甚至于完全的清除。美国麻省理工大学医学中心Phillip Zamore预言“RNA干扰将在哺乳动物细胞遗传学上引起革命性的变化。”人们不再需要花6个月的时间设法去关闭某个基因的表达，利用这项技术，可以在一周之内就可关闭10个基因。
4.1 RNAi技术可发挥重要的作用
4.1.1研究基因功能
6 v" d+ o7 v( i$ A; A! t# j: |  P       与使用基因敲除技术来检测基因功能相比，RNAi技术却能方便，快捷的达到这一目的，即使是在一般条件的实验室也可开展这项工作。利用RNAi技术，科学家已对几乎全部线虫基因(大约19000个基因) 功能进行分析检测。Wianny也报道用dsRNA来阻断小鼠早期胚胎特异基因，包括卵母细胞的c-mos和早期胚胎E-cadherin及GFP转基因的表达。
4.1.2抗病毒作用
1 W7 |, y' Q0 W       我们可将病毒在复制中起关键作用的基因作为目标设计dsRNA来抑制病毒的复制。自1986年植物学家首次利用转入烟草花叶病毒(TMV)的核衣壳(CP)基因导入植株培育出抗病毒植株后，已培育了一大批抗病毒植株。
4.1.3研究转基因沉默机制
      在植物的转基因试验中，经常发生基因沉默。因此，对转基因沉默机制的探索可以为在转基因研究中避免基因沉默提供对策。
4.1.4基因治疗　
6 W6 {" j+ g0 {* r. B       RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的等位基因的表达而达到治疗目的，但又不影响正常等位基因。Wilda等在白血病细胞K562试验中，用对M-BCR/ABL融合基因特异的siRNA转染K562细胞，发现K562细胞中相应的mRNA被清除，并出现强烈的细胞凋亡现象。
9 x" V& V, O# C4.2 发展前景
       通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的ｍRNA，封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。近来也有实验报道通过RNAi研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA与靶ｍRNA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物——Vitravene。RNAi技术与之相比，特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。
. m# I) m- w) K- ^       几乎所有包含已知基因编码序列的dsRNA都能够在体外特异性抑制该基因的功能，类似于基因敲除的效果，基于这些特点，RNAi已被发展成一种探查基因功能的有力工具。线虫中，通过RNAi检测单个基因功能的分析方法现已扩展为分析整个蠕虫中存在的19000个基因功能的一种有效方法。相似的策略在植物及其它生物中也得到应用。